青蓝和

新城疫病毒的P基因
新城疫病毒(NDV)是副粘病毒亚科Avulavirus属的模式种⑴。该病毒的基因组由NP、P、M、F、HN、L六个基因组成，其中的P基因的转录具有RNA编辑现象，不编辑或编辑翻译产生P、V、W三个蛋白。P蛋白（磷蛋白）是由于被高度磷酸化而得名的，其与L蛋白一起构成RNA聚合酶（P-L），对病毒RNA的合成起中心调节作用。V蛋白能阻止宿主干扰素系统的激活，并与病毒的毒力及宿主谱有关。W蛋白的功能还不明确。本文就有关P基因的近期研究进展作一综述。
1．     结构
１.1     ＮDV的P基因，在保守的484位编辑部位（3′-UUUUUCCC-模板链）通过聚合酶打滑机制，插入1个或2个非模板G（鸟嘌呤）残基，进行编辑。转录P mRNA（未编辑）翻译形成P蛋白。转录插入1个G残基的V mRNA（a+1移码新读框）翻译形成V蛋白。转录插入2个G残基的W mRNA（a+2移码新读框）翻译形成W蛋白。
P蛋白核苷酸序列含1185-1188个核苷酸（nt），编码395-396个氨基酸（aa），计算分子量42241（BC株）。GenBank P24698的BC/45株与Q06427的Ulster/2C株为1185nt，编码395个aa⑴。长春株为1188nt，编码396aa⑵。La Sota，B1，Clone-30和ZJ1株为1187nt，396aa⑶。
V蛋白GenBank Q06428的 Ulster/2C株含717nt，编码239aa⑴，计算分子量36000。V蛋白的C端结构域是相对保守的，包含7个半胱酸残基富集区结合二个锌原子一起形成一个锌指基序⑷。
W蛋白的编码氨基酸残基数量各毒株之间有差异，Ｄ26株145aa、BC株221aa、AV株228aa⑸。
P、V、W三个蛋白是共一个N端的，但各有自己的C端，各个C端的长度和氨基酸组成均不相同。据Mebatsion T等（2001）研究了P-基因诱导P、V和W三个蛋白产生的频率，对rNDV 41个独立的克隆进行测序。41个克隆中，28个（68.3%）被测序的质粒编码P蛋白的未编辑版本，12个（29.3%）编码插入一个非模板G残基的V蛋白，仅1个质粒（2.4%）具有二个非模板G残基的插入而编码为W蛋白。所以说，NDV中三个共N端的P-基因诱导蛋白P、V和W产生的大致频率各为68%、29%和2% ⑹。
１.２     病毒基因组编码的结构蛋白，主要用于构成衣壳。P蛋白是NDV的结构蛋白之一。但较早期的研究⑺和专著⑻，认为V蛋白和W蛋白是非结构蛋白。据较近期的文献指出，发现NDV的V蛋白如猿病毒5（SV5）和腮腺炎病毒（mumps virus）的V蛋白一样是掺入病毒粒子中的，不象仙台病毒（sendai virus）和麻疹病毒（measles virus，MV）的V蛋白那样不掺入病毒粒子⑼。NDV和SV5的V蛋白显示是与锌结合的以及也被证明是病毒粒子的结构蛋白⑹。至于W蛋白是否结构蛋白，未见文献明确指出。
2．     功能
２.１ P蛋白与L蛋白一起构成病毒RNA聚合酶（P-L），对病毒RNA的合成起中心调节作用。P蛋白还能与未组装的NP蛋白前体NP°结合，形成P-NP°复合物，这种复合物既可以激活病毒基因组复制，也可以阻止NP°与病毒RNA组装生成核衣壳⑽。
２.２ V蛋白具有多重功能，直接作用于病毒复制、作为NDV的一个毒力因子、限制宿主范围和延缓感染细胞的凋亡等。
2.2.1直接作用于病毒复制。Mebatsion T等（2001）应用反向遗传操作技术在细胞培养    
中得到了二个编辑缺陷突变体，与野型（wt）病毒比较，一个突变体在V蛋白编辑部位缺少6个核苷酸，另一个突变体缺少V蛋白的C端。这二个突变体由于不能表达V蛋白，在培养中只产生了少于wt病毒5000倍的感染性后代，由此显示V蛋白在NDV的复制中起着极重要的作用⑹。
2.2.2     V蛋白也是一个NDV的毒力因子。前述二个编辑缺陷突变体，在6日龄鸡胚中的产量比wt病毒低20万倍不能引起任何胚胎的死亡，即使连续传代以后也完全不能在10日龄的鸡胚中生长，这就表明V蛋白也是一个NDV的毒力因子⑹。
2.2.3 V蛋白限制NDV的宿主范围。Park MS等（2003）在另一研究结果中显示,wtNDV在其感染的Hep-2或A549二个人细胞系中的滴度10倍地低于rNDVV(-)/NS1(把流感病毒的NS1基因插入到剔除V的rNDV基因组中)感染的滴度。相对应地，由感染wtrNDV的人细胞分泌的干扰素水平是更多地高于由感染rNDVV(-)/NS1的人细胞。NDV V在病毒感染时阻止CEF（鸡胚成纤维细胞）中IFN（干扰素）的产生但不能在人细胞阻止IFN的产生。这就提示NDV V蛋白的IFN拮抗剂活性是具有种特异性的，NDV的宿主范围受到其V蛋白抵抗宿主防卫能力的限制⑾。
2.2.4     V蛋白的表达延缓了在NDV感染CEF中的细胞凋亡。染色质浓缩是细胞凋亡的一个标志。为了证实染色质浓缩和DNA断裂，进行了TUNEL试验。病毒感染CEF和Hep-2细胞后的24和48小时进行TUNEL染色以检查具缺口的染色质的DNA的存在。TUNEL阳性CEF仅在用rNDVV(-)2ch（不表达V和W蛋白）感染后出现，其水平自感染后24-48小时不断增加。为了达到有效的病毒生长和其后的播散，成功的病毒复制需要逃避细胞凋亡前的一些机制，V蛋白质具有这一功能⑾。
2.2.3 V蛋白影响病毒复制和作为NDV的一个毒力因子，是通过拮抗宿主IFN活性来实现的，以及这种活性是定位于V蛋白的C端中。Park MS等（2003）构建了一个在基因组中插入绿色荧光蛋白基因（GFP）的NDV重组体，来确定V蛋白的功能及其功能定位。绿色荧光蛋白基因是目前在光学分子成像中应用较多的一种报告基因，通过对其转染后表达的绿色荧光蛋白进行成像，间接地反映与其相连的目的基因，可用荧光显微镜观察。他们对CEF在感染前1天每毫升用500或1000单位的鸡IFN-α/β处理，病毒的GFP表达很大的减少，提示病毒的复制显著地受到损伤。然而，当IFN添加后8小时再加入抗鸡IFN抗体中和，病毒的GFP表达得到了恢复。又对构建的三种质粒编码（全长P蛋白、与P蛋白共享的V蛋白的N端、V蛋白的与P蛋白不同的C端结构域）在CEF中对NDV-GFP表达恢复的作用进行了试验，试验证明，V蛋白的C端结构域和全长V蛋白能挽救GFP的表达，VN不能P也不能挽救NDV-GFP生长。对来自这些实验的绿色荧光相对强度的分析证明，或是全长V蛋白或是其C端结构域导致了一个平均大致是VＮ、P感染细胞的13倍之多的GFP荧光强度。这些结果指出NDV的V蛋白具有IFN拮抗剂活性，以及这种活性是由NDV的V蛋白C端编码的⑷。Huang Z等（2003）稍后的研究也得到了相似的结果，并指出NDV的V蛋白拮抗干扰素的功能是通过降解STAT 1（细胞转导和转录激活因子1）实现的⑼。
2.3 W蛋白在恢复病毒的毒力和复制中具有作用的可能性尚不能从一些实验中排除。然而，在先前的实验中的重组体，或缺乏V和W蛋白、或仅缺乏V蛋白的C端，在复制和毒力方面表现相同的缺陷。这个发现，有力地提示是V而不是W对恢复病毒毒力和病毒的复制有关⑿。
３．应用和展望
3.1     应用于开发疫苗的研究。Mebatsion T等（2001）把NDV的P基因的编辑位点负义链的U（尿嘧啶）片段一个U改变为C（胸嘧啶）构建了一个突变体（NDV-P1）。NDV-P1在9-11日龄鸡胚中传代2或3次病毒的增殖才可由HA试验检出，经5或6次卵传后的感染滴度各为每毫升6.7和7.1 log10EID50，这至少100倍地低于父代病毒3次卵传后得到的滴度（9.2 log10EID50/mL）。由用蛋白印迹对稀释标本的分析显示NDV-P1的V蛋白含量大致20倍地低于rNDV。NDV-P1的毒力比其父代至少减弱超过10的6次方倍，即使剂量高达6 log10EID50/mL也不能致死8日龄以后的SPF鸡胚。将NDV-P1接种18日龄SPF鸡胚，3.5㏒10EID50剂量的保护率达95%，4.3和5.4剂量时的保护率均达100%，所有对照鸡在攻毒3天内死亡。将NDV-P1应用于商业鸡胚的免疫，免疫胚的出雏率和雏鸡体重均与对照组没有差异，5.7㏒10EID50剂量保护率可达85%，证明NDV-P1具有突破母抗和提供保护的能力，是一个有前途的胚胎疫苗候选者。遗传操作向着减少V蛋白表达而不是完全破坏,是开发活的致弱的NDV更好应答疫苗的方略⑹。
3.2 对P基因的的遗传操作致弱病毒也可作为一个免疫剌激蛋白的表达，或作为其它禽病原体疫苗的有吸引力的载体。
3.3 由于NDV在选择性地杀死人类和动物的肿瘤细胞显现了可喜的效果，构建NDV重组体的技术，将有助于为人类和动物生产出安全和有效的抗癌药药物及疗法。
3.4 P基因编辑现象中，编辑位点的识别和G残基的插入可能是两个有区别的过程，它们联合实施调节P-基因mRNA编辑，对这种编辑的精确机制需进一步地研究揭示。V蛋白中决定毒力和致病性的氨基酸需要进一步的鉴定。V蛋白的抗细胞凋亡活性是不是由它的IFN拮抗剂活性所介导也应弄清楚。关于W蛋白还很不了解，极需深入研究等。
  主要参考文献
⑴     http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/
⑵     王承宇，金宁一，丁壮等．新城疫病毒长春株NP、P、M蛋白基因的克隆与序列分析〔J〕．中国兽医学报，2000，22⑶：213-215
⑶     黄勇，万洪全，刘红旗等．鹅源新城疫病毒ZJ1株全基因组的序列测定〔J〕．病毒学报，2003，19⑷：348-354
⑷     Park MS,Shaw ML,Muñoz-Jordan J et al . Newcastle disease virus (NDV)-based assay demonstrates interferon-antagonist activity for the NDV V protein and the Nipah virus V,W,and C proteins〔J〕. J Virol ,2003.1, 77⑵:1501-1511
⑸     刘玉良，刘秀梵．新城疫病毒Ｐ基因的RNA编辑及其抗干扰素作用〔J〕．动物医学进展,2004,25⑹：1-3
⑹     Mebatsion T , Verstegen S , de Vaan LTC et al〔J〕. A recombinant Newcastle disease virus with low-level V protein expression is immunogenic and lacks pathogenicity for chicken embryos〔J〕.J Virol , 2001 , 75⑴:420-428
⑺     Chambers P , Samson AC . Non-structural proteins in Newcastle disease virus-infected cells〔J〕. J Gen Virol , 1982,58⑴:1-12
⑻     Fields BN , Knipe DM et al .Virology〔M〕. New York : Raven Press , 1990 . 945-962
⑼     Huang Z , Krishnamurthy S , Panda A et al . Newcastle disease virus V protein is associated with viral pathogenesis and functions as an alpha interferon antagonist〔J〕. J Virol ,2003.8 , 77⒃:8676-8685
⑽     徐耀先等．分子病毒学〔Ｍ〕．武汉：湖北科学技术出版社，２000．289-290
⑾     Park MS , Adolfo García-sastre , Jerome F. Crose et al . Newcastle disease virus V protein is a determinant of host range restriction〔J〕. J virol , 2003.9,77⒄:9522-9532
⑿     Mebatsion T , de Vaan LT , de Hass et al . Identification of a mutation in editing of defective Newcastle disease virus recombinants that modulates P-gene , mRNA editing and resores virus replication and pathogenicity in chicken embryos〔J〕. J Virol ,2003,77⒄:9259-9265